Самым совершенным способом обнаружения генетического материала возбудителей инфекций животных является ПЦР в режиме реального времени. Прямой метод лабораторной диагностики, использующий прямую детекцию продуктов амплификации за счет возбуждения введённых в реакционную среду специальных флуоресцентных маркеров, позволяет повысить экспрессность анализа, получить конечные результаты еще в процессе исследования и исключить неправильную интерпретацию.
Сущность метода ПЦР в режиме реального времени
Real-Time PCR – это ДНК-технология, основанная на методе полимеразной цепной реакции, включающая одновременно амплификацию, детекцию и измерение количества молекул ДНК. Гибридизационно-флуоресцентная детекция и количественный анализ продуктов амплификации происходит непосредственно в реакционной среде. Для этого в состав исследуемой смеси вводятся комплементарные продукту амплификации флуоресцентные зонды (метки) — олигонуклеотиды, содержащие флуорофоры и гасители флуоресценции. В зависимости от вида, зонды срабатывают в фазе элонгации или в фазе отжига. И в том и другом случае хромофор и гаситель пространственно разобщаются, что приводит к повышению флуоресцентного сигнала-отклика, фиксирующегося детектирующим амплификатором в режиме реального времени.
Особенности реал-тайм-ПЦР
Преимуществом метода ПЦР-диагностики в реальном времени является возможность количественного анализа продуктов амплификации после каждого цикла и кинетику процесса амплификации. Применение Real-Time PCR-оборудования в выявлении возбудителей вирусных и бактериальных инфекций животных значительно расширяет спектр аналитических возможностей. Оно позволяет проводить следующие операции:
- одновременную идентификацию нескольких мишеней в одной пробирке;
- измерение экспрессии генов в отдельных клетках или тканях;
- термодинамический анализ плавления дуплексов.
Использование автоматических термостатов, корректирующих температуру в соответствии с заданной программой, существенно упрощает диагностическую процедуру, делает ее более чувствительной и специфичной, минимизирует риск перекрестной контаминации.
Сфера применения ПЦР-диагностики в режиме реального времени в ветеринарии
Внедрение в практику современных амплификаторов-термоциклеров и специализированных наборов реагентов позволило поставить технологию ПЦР-ВР «на поток» и усовершенствовать систему лабораторного контроля. Качественный и количественный мультиплексный анализ дает возможность обнаруживать возбудителей инфекции:
- непосредственно в организме животного;
- в продуктах питания;
- пробах окружающей среды.
Применение автоматических станций работы с образцами упрощает выделение нуклеиновых кислот из биологических жидкостей (крови, мочи, слизи, гноя, мокроты, желчи и пр.), биоптата внутренних органов, кожной, жировой тканей, фекалий и не только. ПЦР-диагностика в режиме реального времени является эффективным инструментом прямого обнаружения бактерий, вирусов, грибков, простейших и одноклеточных паразитов, опасных для животных, птиц, рыб, рептилий и пр.
Спектр возможностей ПЦР-ВР
Молекулярно-генетический метод Real-Time PCR позволяет выявлять и идентифицировать возбудителей практически всех известных ветеринарной медицине инфекций. Технология допускает проведение как прижизненной, так и посмертной диагностики. Она признана обоснованным методом дифференциации инфекционных заболеваний со схожими клиническими проявлениями. При подозрении на инфицирование выполняется качественное исследование биоматериала, для оценки уровня содержания патогена – количественный вариант. Последний также дает возможность контролировать динамику заболевания и эффективность этиотропной терапии, выявлять резистентные штаммы, нецитопатогенных и некультивируемых возбудителей, оценивать качество антигенного сырья для производства вакцин. Автоматическая регистрация, интерпретация результатов и возможность проведения сравнительного анализа графических изображений в подавляющем большинстве случаев позволяют верифицировать диагноз и подобрать самый оптимальный способ лечения.